El enlace peptídico: qué es y por qué es plano
Dos aminoácidos se unen soltando una molécula de agua, y el enlace que queda no gira. Esa rigidez decide cuántos residuos cuenta el COA, qué masa reporta el espectrómetro, a qué longitud de onda se lee la pureza y dónde se rompe la molécula si se guarda mal.
Se forma perdiendo agua
Un aminoácido aporta su carboxilo (−COOH), el siguiente aporta su amino (−NH₂) y los dos reaccionan. Sale una molécula de agua y queda un enlace amida: el enlace peptídico. Por eso lo que queda encadenado ya no es el aminoácido completo sino un residuo, y pesa 18.02 Da menos que el aminoácido libre del que proviene.
Un enlace que no gira
Escrito como C(=O)–NH parece un enlace sencillo entre carbono y nitrógeno, y debería girar libremente. No lo hace. El par de electrones libre del nitrógeno se deslocaliza hacia el carbonilo, y el enlace C–N adquiere carácter parcial de doble enlace: su longitud queda cerca de 1.32 Å, entre un C–N sencillo (≈1.47 Å) y uno doble (≈1.27 Å). Girar sobre él exige romper esa deslocalización, con una barrera del orden de 20 kcal/mol.
La consecuencia es geométrica. Seis átomos quedan en un mismo plano y la cadena solo puede doblarse en los enlaces vecinos, φ y ψ, a ambos lados de cada carbono α. Una cadena de péptido no es un hilo flexible sino una serie de placas rígidas articuladas. De ahí sale todo lo demás: qué conformaciones puede adoptar, qué tan rápido se agrega y qué caras quedan expuestas al disolvente.
Conviene decir hasta dónde llega esa idea. El plano es un modelo excelente, no una ley. Jaskolski y colaboradores revisaron el Protein Data Bank y la Cambridge Structural Database y concluyeron que algunos valores de referencia deben ajustarse, entre ellos el del enlace C–N, y que la planaridad conviene imponerla con menos énfasis del habitual al refinar una estructura [2]. Una estructura de neutrones a 1.2 Å resolvió después las posiciones de los propios protones amida y encontró que se desvían del plano hacia sus aceptores, con una dependencia fuerte de la piramidalización del nitrógeno [1]. El enlace es rígido; perfectamente plano, no siempre.
Casi siempre trans
El ángulo ω ronda los 180° en la enorme mayoría de los enlaces, y solo una proporción muy pequeña aparece en cis, cerca de 0° [3]. La isomerización entre ambos interviene en plegamiento, interfaces de dimerización y apertura de canales, y buena parte de los enlaces cis pasó desapercibida por resolución insuficiente.
La prolina rompe el patrón
Su nitrógeno forma parte de un anillo y carece del hidrógeno que el resto usa para puentes. Ahí el cis deja de ser raro: en péptidos cortos con prolina se han medido relaciones cis/trans de hasta 3.65 según el contexto de secuencia [4]. BPC-157 lleva cuatro prolinas en quince residuos.
Absorbe a 214 nm
El grupo amida absorbe en el ultravioleta lejano. Como cada residuo aporta uno, la respuesta es comparable a lo largo de la secuencia, y por eso la cómo mide la pureza el HPLC se integra a esa longitud de onda y no a 280 nm.
De tres residuos a cuarenta y cuatro
«Péptido», «polipéptido» y «proteína» describen el mismo enlace a distintas longitudes. Se habla de oligopéptido hasta unos veinte residuos, de polipéptido por encima, y de proteína cuando la cadena adopta una estructura tridimensional definida. Los cortes son convencionales y cambian de un autor a otro. El catálogo cubre buena parte del rango:
| Compuesto | Residuos | Secuencia o clase | Nombre por longitud |
|---|---|---|---|
| GHK-Cu | 3 | Gly-His-Lys + Cu²⁺ | tripéptido |
| Epithalon | 4 | Ala-Glu-Asp-Gly | tetrapéptido |
| Ipamorelina | 5 | secretagogo de GH | pentapéptido |
| Semax | 7 | Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro | heptapéptido |
| BPC-157 | 15 | GEPPPGKPADDAGLV | pentadecapéptido |
| MOTS-c | 16 | origen mitocondrial | oligopéptido |
| Retatrutide | 39 | triagonista GIP/GLP-1/glucagón | polipéptido |
| Tesamorelina | 44 | análogo de GHRH | polipéptido |
La numeración corre del extremo amino (N-terminal, izquierda) al carboxilo (C-terminal, derecha). Cuando una ficha nombra la posición 1 de una secuencia, se refiere al residuo del extremo amino.
El mismo enlace decide la caducidad
Un enlace amida es estable en seco y vulnerable en agua. Reconstituir un vial pone en marcha la cuenta: la hidrólisis corta la cadena, y ciertas secuencias tienen además rutas propias de degradación que no requieren corte. La desamidación de asparagina es de las más comunes, y se concentra en puntos calientes de secuencia: Asn-Gly, Asn-Ser y Asn-Thr [5]. Pasa por un intermediario cíclico de succinimida que al reabrirse entrega una mezcla en la que aparece el isoaspartilo.
Aquí está la razón práctica de que el COA lleve dos pruebas y no una. En un péptido con motivo NGR se documentó que el producto isoaspartilo puede coeluir con el original en HPLC, de modo que la cromatografía sola no lo separa y hace falta espectrometría de masas para comprobar la pureza [6]. Del lado de la fabricación, el mismo residuo de aspartato tiene su propia ruta de fallo, la aspartimida, bien caracterizada en síntesis Fmoc y que obliga a cambiar la protección de la cadena lateral [7].
Esto explica por qué el producto se despacha liofilizado en vial sellado y no en solución, y por qué la temperatura de conservación cambia según esté el polvo sellado o el vial ya reconstituido.
Qué verifica el COA sobre la cadena
La masa por espectrometría contrasta que la secuencia sintetizada corresponde a la declarada, incluidas las modificaciones de los extremos. La pureza por HPLC estima cuánta del área integrada corresponde a la señal principal. Las dos lecturas son complementarias, y el caso del isoaspartilo muestra por qué ninguna sustituye a la otra: ver espectrometría de masas y cómo leer un COA.
Literatura citada
Referencias indexadas en PubMed. Los enlaces apuntan al DOI de cada artículo.
- Hanazono Y, Hirano Y, Takeda K, Kusaka K, Tamada T, Miki K. Revisiting the concept of peptide bond planarity in an iron-sulfur protein by neutron structure analysis. Sci Adv. 2022;8(20):eabn2276. 10.1126/sciadv.abn2276
- Jaskolski M, Gilski M, Dauter Z, Wlodawer A. Stereochemical restraints revisited: how accurate are refinement targets and how much should protein structures be allowed to deviate from them? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2007;63(Pt 5):611-20. 10.1107/S090744490700978X
- Craveur P, Joseph AP, Poulain P, de Brevern AG, Rebehmed J. Cis-trans isomerization of omega dihedrals in proteins. Amino Acids. 2013;45(2):279-89. 10.1007/s00726-013-1511-3
- Raghothama S, Raghavender US, Aravinda S, Shamala N, Balaram P. Conformations of heterochiral and homochiral proline-pseudoproline segments in peptides: context dependent cis-trans peptide bond isomerization. Biopolymers. 2009;92(5):405-16. 10.1002/bip.21207
- Zhang YT, Hu J, Pace AL, Wong R, Wang YJ, Kao YH. Characterization of asparagine 330 deamidation in an Fc-fragment of IgG1 using cation exchange chromatography and peptide mapping. J Chromatogr B. 2014;965:65-71. 10.1016/j.jchromb.2014.06.018
- Füzéry AK, Mihala N, Szabó P, Perczel A, Giavazzi R, Süli-Vargha H. Solution state conformation and degradation of cyclopeptides containing an NGR motif. J Pept Sci. 2005;11(1):53-9. 10.1002/psc.588
- Ferreira VFC, Correia JDG, Farinha CM, Mendes F. Improved Fmoc-solid-phase peptide synthesis of an extracellular loop of CFTR for antibody selection by the phage display technology. J Pept Sci. 2020;26(7):e3253. 10.1002/psc.3253
Cada lote con su masa y su pureza
Catálogo analizado por HPLC y LC-HRMS, con COA por lote. Material para investigación (RUO).
Dudas frecuentes
¿Qué es un enlace peptídico?
Es el enlace amida que une el carboxilo de un aminoácido con el amino del aminoácido contiguo. Al formarse se libera una molécula de agua, por lo que cada residuo dentro de la cadena pesa 18.02 Da menos que el aminoácido libre del que proviene.
¿Por qué el enlace peptídico no gira?
El par de electrones libre del nitrógeno se deslocaliza hacia el carbonilo, y el enlace C–N adquiere carácter parcial de doble enlace. Su longitud queda cerca de 1.32 Å, entre un enlace sencillo C–N (≈1.47 Å) y uno doble C=N (≈1.27 Å). Girar sobre él exige romper esa deslocalización, con una barrera del orden de 20 kcal/mol.
¿Cuál es la diferencia entre péptido, polipéptido y proteína?
La distinción es de longitud y de uso, no de química: el enlace es el mismo. Se llama oligopéptido a cadenas cortas de unos 2 a 20 residuos, polipéptido a las más largas, y proteína cuando la cadena adopta una estructura tridimensional definida y funcional. Los límites son convencionales y varían entre autores.
¿Qué es un residuo en un péptido?
Es lo que queda de cada aminoácido una vez incorporado a la cadena, después de perder los átomos que salieron como agua al formarse el enlace. Por eso se cuentan residuos y no aminoácidos: BPC-157 tiene 15 residuos y Epithalon 4.
¿Cómo se calcula la masa molecular de un péptido?
Se suman las masas de los residuos y se añaden 18.02 Da por el agua que cierra los extremos de la cadena. Modificaciones como una acetilación en el extremo amino o una amidación en el carboxilo desplazan ese total, y por eso el valor del COA debe corresponder a la molécula modificada y no a la secuencia desnuda.
¿Por qué la HPLC de péptidos se lee a 214 nm?
Porque el enlace peptídico absorbe en esa región, y como todo residuo dentro de la cadena aporta uno, la respuesta es comparable a lo largo de la secuencia. A 280 nm solo responden triptófano, tirosina y fenilalanina, de modo que un péptido sin residuos aromáticos casi no aparece.